引言

二氢蝶酰十谷氨酸还原酶（Dihydrofolate Reductase，简称DHFR）是一种在叶酸代谢过程中起关键作用的酶，其通过催化二氢叶酸转化为四氢叶酸，参与嘌呤、胸腺嘧啶及其他重要生物分子的合成。DHFR的活性异常与多种疾病相关，包括恶性肿瘤、细菌耐药性及先天性代谢缺陷等。因此，DHFR检测在临床诊断、药物研发和基础研究中具有重要意义。本文将从检测范围、检测项目、检测方法及检测仪器等方面，系统阐述DHFR检测的技术要点与应用前景。

检测范围

DHFR检测广泛应用于以下领域：

• 临床医学：监测癌症患者对甲氨蝶呤（MTX）等化疗药物的耐药性；
• 微生物学：评估病原菌对磺胺类药物的敏感性；
• 遗传学：筛查先天性叶酸代谢障碍相关基因突变；
• 药物研发：评价新型DHFR抑制剂的活性与选择性。

检测项目

DHFR检测的核心项目包括：

• 酶活性测定：通过底物转化速率评估DHFR催化效率；
• 蛋白表达水平：定量分析细胞或组织中DHFR的浓度；
• 基因表达分析：检测DHFR基因的mRNA转录水平；
• 突变筛查：识别DHFR基因的致病性变异位点。

检测方法

目前主流的DHFR检测方法可分为以下三类：

1. 分光光度法

该方法基于DHFR催化反应中辅酶NADPH的氧化过程，通过监测340 nm波长处吸光度的变化，计算酶活性。其操作步骤包括：

• 制备含有二氢叶酸、NADPH和待测样本的反应体系；
• 在恒温条件下记录吸光度随时间的变化曲线；
• 根据标准曲线或公式计算酶活性单位。

此方法灵敏度高、成本低，但易受样本杂质干扰。

2. 液相色谱法（HPLC）

HPLC通过分离并定量反应产物四氢叶酸，间接反映DHFR活性。关键技术参数包括：

• 色谱柱：C18反相色谱柱；
• 流动相：甲醇-磷酸盐缓冲液梯度洗脱；
• 检测波长：290 nm（叶酸类物质特征吸收峰）。

该法准确度高，适用于复杂生物样本的分析，但设备昂贵且耗时较长。

3. 免疫分析法

采用抗DHFR单克隆抗体进行免疫印迹（Western Blot）或酶联免疫吸附试验（ELISA），定量检测DHFR蛋白表达水平。以ELISA为例：

• 将待测样本包被于微孔板；
• 依次加入一抗、酶标记二抗及显色底物；
• 通过吸光度值计算DHFR浓度。

此方法特异性强，适合高通量筛查，但需严格优化抗体反应条件。

检测仪器

DHFR检测需依赖多种精密仪器，主要包括：

• 紫外-可见分光光度计：用于分光光度法的吸光度检测；
• 液相色谱仪：配备自动进样器和紫外检测器；
• 酶标仪：支持ELISA等微孔板检测技术；
• 实时荧光定量PCR仪：用于DHFR基因表达分析。

仪器选择需综合考虑检测目标、通量需求及预算限制。例如，科研实验室多采用HPLC与PCR联用方案，而临床检验科更倾向自动化酶标仪。

结论

DHFR检测作为连接基础研究与临床应用的桥梁，其技术发展推动了精准医学的进步。通过分光光度法、HPLC及免疫分析法的多维度整合，可全面评估DHFR的活性、表达及遗传特征。未来，随着单细胞测序与质谱技术的突破，DHFR检测的灵敏度与分辨率将进一步提升，为个体化治疗提供更可靠的依据。建议相关领域加强方法标准化研究，并开发便携式检测设备，以满足基层医疗机构的迫切需求。

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